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如何利用CRISPR系统实现精确的基因knockin?

作者 : admin 发表时间 : 2015-03-03

CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现彻底改变了生物学领域,也迅速成为许多实验室的必备工具。这种编辑技术不仅可以用在基因敲除(knockout),也可以用于基因敲入(knockin),也就是在目标位点精确引入一段DNA序列,以便产生特定突变或插入新元件。这是通过DNA双链断裂后的同源定向修复机制实现的。

大家都知道,在真核细胞中,DNA双链断裂的修复机制主要有两种:非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。HDR被认为是更准确的断裂修复机制,但它需要修复模板的存在,同时要求受损DNA和供体DNA链之间具有更高的序列同源性。

也许有人要问:我应该使用哪种修复模板,双链DNA还是单链DNA?其实,这取决于您想要实现的修饰。若希望引入较小的修饰,如单点突变或50 bp以下的突变,那么单链DNA是个很好的选择。若希望插入较大的片段,比如荧光蛋白或选择元件,那么就需要较长的DNA供体。这个供体可以是双链DNA,也可以是单链DNA。

不过,需要注意的是,双链DNA存在随机整合到基因组上的风险,因此在精确的基因编辑上的应用非常有限。相比之下,单链DNA随机整合的风险大大降低,主要是插入Cas9/sgRNA复合物所靶定的位点。此外,单链DNA供体模板对细胞的毒性要远低于双链DNA模板。

尽管单链DNA的优点多多,但它的制备难度较大,费用也颇高。以往,人们只能经济、无误地合成200 bp以下的单链DNA。一旦超过了这个长度,单链DNA的合成就变得非常昂贵,也容易出错。好在,Takara旗下的Clontech品牌近日推出了Guide-it Long ssDNA Strandase Kit,可制备长达5 kb的单链DNA寡核苷酸。

这个试剂盒提供了一种简便的方法来制备CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术的基因敲入实验修复模板。它选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链(sense strand)或者反义链(antisense strand),将其转化为单链DNA。

具体的制备过程如下(图1)。首先,通过合适的方法(克隆、融合PCR等)制备dsDNA起始模板,dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂,模板中间是欲knockin的外源序列。然后,在dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物,制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A,开始消化正义链或反义链。接着,添加Strandase Mix B完成降解反应,从而获得ssDNA。最后,纯化ssDNA产物用于knockin实验。Clontech专家建议,同时制备ssDNA正义链和反义链并独立用于knockin实验。



图1. 长单链DNA(long ssDNA)供体模板制备步骤示意图。

至于ssDNA作为修复模板,效果如何,是否随机整合?研究人员也给出了详细的答案。他们打算在HEK293细胞的GAPDH的C-末端定点敲入AcGFP1基因(图2)。于是,他们设计的HDR供体模板的同源臂序列为GAPDH第8外显子的末端序列,AcGFP1与GAPDH处于同一阅读框(图A)。之后,他们通过流式细胞术比较了dsDNA和ssDNA分别作为修复模板的实验结果(图B)。

结果显示,以dsDNA作为修复模板时,即使没有Cas9 RNPs,仍然出现相当多的带有绿色荧光的细胞克隆。然而,以长ssDNA正义链或反义链作为修复模板时,只有同时加入Cas9和sgRNA,才会发生整合反应;而没有Cas9 RNPs时,则没有检测到荧光背景,说明不发生整合反应。如此看来,ssDNA随机整合的风险的确大大降低。



图2. 在HEK293细胞的GAPDH的C-末端定点敲入AcGFP1基因。

此外,研究人员还比较了在knockin实验中导入dsDNA和ssDNA所产生的细胞毒性。他们使用Cellartis hiPSC18细胞系。插入序列为AcGFP1,其作用是用于标记tubulin。结果显示,即使没有加入Cas9,dsDNA的导入仍然可以引起显著的细胞毒性。



图3. 比较knockin实验中导入dsDNA和ssDNA所产生的细胞毒性。

现在,您可以轻松愉快地制备ssDNA修复模板了吧,既不用担心dsDNA的随机整合,也无需忧虑dsDNA所带来的细胞毒性。之后,ssDNA可通过电穿孔或试剂转染的方法导入细胞,具体要取决于您研究的细胞类型。

对于电穿孔方法,同时导入细胞的还有sgRNA(利用Guide-it sgRNA体外转录试剂盒制备)以及Guide-it Recombinant Cas9。至于传统的转染实验,您可以选择同时表达Cas9和sgRNA的一体化表达载体,比如Guide-it CRISPR/Cas9 System,与ssDNA共转染。高大上的knockin实验,就是这么简单!