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如何利用CRISPR改造植物基因组[创新技巧]

作者 : admin 发表时间 : 2015-03-03

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如今,CRISPR技术已经用于许多植物基因组的改造,包括著名的模式生物,如拟南芥和蒺藜苜蓿,以及重要的经济作物,如马铃薯、玉米、小麦、水稻和蘑菇等。尽管CRISPR系统在大多数物种中都通用,但涉及到植物细胞的编辑,还是不能一成不变。

Addgene的Joel McDade在此介绍了植物基因组的改造,突出了CRISPR系统针对植物的特定改变,并概括了科研人员的植物基因组编辑工具。

CRISPR的各个组分

总的来说,之前的实验设计规则也适用于植物的基因编辑。不过,常用的CRISPR质粒可能需要做一些改变,才能在植物细胞中起作用。与其他模式系统一样,Cas9或Cas9变异体和单链向导RNA(gRNA)的表达就足以修饰植物的基因组。

与其他生物一样,gRNA也是由~20个核苷酸的靶向序列和~75个核苷酸的支架序列组成,不过驱动gRNA表达的启动子则取决于所使用的细胞类型。在植物细胞中,gRNA的表达可通过植物特异的RNA pol III启动子来驱动,如AtU6、TaU6、OsU6或OsU3。Addgene提供了30多种不含gRNA的骨架,方便你插入靶向序列,最快构建好载体。

目前,研究人员已经对一些Cas9变异体进行密码子优化,以加强在植物细胞中的翻译。同时,他们也使用缺乏核酸酶活性的Cas9激活物(如dCas9-VP64)或阻遏物(dCas9-KRAB 或dCas9-SRDX)来激活或抑制植物细胞中的目标基因。

Cas9表达通常是由植物来源的RNA pol II启动子驱动的。举个例子,常用的RNA pol II启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)或泛素启动子。Addgene也提供了含有Cas9的质粒,可用于目标基因的敲除、激活和抑制。之前提到的许多不含gRNA的骨架也包含Cas9,可同时表达Cas9和gRNA。

将这些组分导入植物细胞

一旦万事俱备,下一步就是将CRISPR组分导入细胞了。记住,这些组分的高效导入对任何实验而言都是至关重要的,若gRNA或Cas9表达失败,结果肯定不乐观。CRISPR组分可瞬时表达,也可稳定表达,这取决于导入方法和细胞类型。

你可以选择用PEG(聚乙二醇)来导入CRISPR组分并瞬时表达,但这种方法仅限于原生质体细胞,也就是细胞壁被去除的植物细胞。你也可以选择农杆菌介导的导入,它利用农杆菌作为载体,将你感兴趣的基因导入目的细胞。Johannes Stuttmann实验室提供了pDGE Dicot Genome Editing Kit,包含了各种带有Cas9且与农杆菌兼容的载体。

对于植物的基因组改造,尽管许多细节不同,如启动子、蛋白序列或转染方法,但基本原理还是与其他系统无异。目前已经有很多文献发表,也有很多工具出现,因此你完全不必担心。大胆地去试试吧

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